Rezultate științifice
Rezumat executiv al activităților realizate în cadrul proiectului PN-III-P1-1.1-PD-2021-0552
Hidrogeluri multicomponent cu structură hibridă pentru terapia melanomului malign cutanat obținut in situ prin tehnologie de iradiere (HYDRO-CAN)
CONTRACT NR. PD 20/2022
ETAPA 1 – 2022
În această etapă de proiect au fost sintetizate prin iradiere cu electroni accelerați 3 rețete de hidrogeluri multicomponente (având indicativele PD81, PD9 și PD10). Hidrogelurile au fost obținute din amestecuri polimerice apoase în care s-au utilizat proporții diferite de: gel de colagen bovin, carboximetilceluloză de sodiu, polivinilpirolidonă, chitosan și polietilen oxid. Reacția de reticulare a fost realizată exclusiv prin iradiere la 25 kGy, doză de iradiere suficientă atât pentru finalizarea reacției de reticulare, dar și eficientă din punct de vedere a sterilizării hidrogelului. Hidrogelurile obținute au fost testate din punct de vedere a stabilității fizice și chimice, proprietăți mecanice, compozițional, structural și morfologic.
Hidrogelurile dezvoltate în acest proiect sunt transparente, își mențin structura, sunt neadezive la manipulare și cel mai important, mai ales din punct de vedere al aplicației, prezintă structură elastică.
Figura 1. Aspectul hidrogelurilor obținute după iradiere în diferite ipostaze.
Hidrogelurile PD81, PD9 și PD10 au prezentat grade de gonflare/umflare diferite în apă deionizată și soluții tampon. Compoziția PD81 a manifestat cel mai mare grad de umflare (1100% - 3250% -1400%-1100% ) în medii cu pH 5.4-6.5-7.4-9.4, în aceste condiții hidrogelurile sunt stabile și nu disociază în mediul de gonflare.
Hidrogelurile obținute prin iradiere au comportament reologic caracteristic solidelor moi, prezintă rețea macromoleculară permanentă predominant elastică. Hidrogelurile PD81 și PD 9 au prezentat cele mai mari valori ale lui G’ cuprinse între 9697 Pa și 14980 Pa.
Hidrogelul PD81 a prezentat cea mai crescută densitate de reticulare (Ve = 1,17 mol/m3), ceea ce arată formarea unui hidrogel cu structură densă și stabilitate ridicată. Hidrogelul PD10 a prezentat o scădere semnificativă a densității de reticulare, corelată de asemenea și cu scăderea modulului de elasticitate. Aceste rezultate au fost sugestive pentru selecția compozițiilor PD81 și PD9 în vederea continuării studiilor viitoare. Hidrogelurile mențin între 84,8% și 89,2% din umiditate, timp de 12 ore, ceea ce asigură un mediu benefic pentru o vindecare mult mai rapidă a plăgilor.
Din punct de vedere compozițional, din analiza spectrelor XPS s-au evidențiat picuri de intensitate semnificativă specifice legăturilor C-C (284.4 eV), care sugerează că structura hidrogelurilor nu este degradată ca urmare a procesului de iradiere. În cazul hidrogelului PD10 s-a observat o contribuție mai crescută a legăturilor (C=O) și (O=C–O) care a fost asociată cu procese degradative în structura hidrogelului PD10.
Din punct de vedere morfologic, hidrogelurile PD81 și PD9 prezintă structură poroasă cu pori interconectați și distribuiți într-o manieră omogenă. Hidrogelul PD81 prezintă în structura sa, micropori distribuiți uniform, această structură are capacitate de gonflare mai bună în medii cu pH diferit, ceea ce îi conferă și o capacitate de încărcare mai bună a acestui hidrogel, cu medicamente.
Testarea potențialului citotoxic al medicamentului liber (DOX) asupra celulelor de melanom din linia A375 în domeniile de concentrație 1.56 – 200 µg/ml și 0.01 – 1.56 µg/ml a evidențiat că doza IC50 este reprezentată de intervalul de concentrații 0.01 µg/ml – 0.04 µg/ml.
Evaluarea in vitro a potențialului de biocompatibilitate a hidrogelurilor dezvoltate a demonstrat că performanța biologică cea mai mare în calitate de pansamente pe leziuni la nivelul tegumentului este manifestată de probele PD81 și PD9, în special PD81, fapt pentru care dozele IC50 selectate au fost încărcate în hidrogelul PD81. Aceste hidrogeluri au fost ulterior investigate privind biocompatibilitatea lor cu liniile celulare de fibroblaste dermale (CCD 1070SK) și de celule epiteliale (VERO) demonstrând ca ele sunt tolerate de celulele normale.
ETAPA 2 – 2023
În Act. 2.1 obiectivele principale au avut ca scop principal determinarea profilelor de biodegradare și a mecanismelor de eliberare in vitro în regim dinamic a substanțelor active la pH fiziologic, rană infectată și mediu tumoral. Totodată s-a urmărit și cuantificarea concentrației maxime de încărcare și de eliberare a moleculelor bioactive (DOX) cu efect anti-tumoral. În primele 50 de zile, procentul de biodegradare a fost de 0.04 %. Rata scăzută de biodegradare a hidrogelului PD81 poate fi asociată cu o rețea permanent reticulată formată prin iradiere. După menținerea hidrogelului în mediu fiziologic timp de 84 de zile, rata de biodegradare a crescut, iar hidrogelul a pierdut doar 0.10% din masa inițială. Acest rezultat demonstrează că hidrogelul testat are structură stabilă. Cuantificarea cantității de DOX încărcată și respectiv eliberată din hidrogeluri a fost determinată prin cromatografie de lichide utilizând sistemul cromatografic HPLC Agilent 1260 Infinity II.
Rezultatele experimentale privind cantitatea de DOX încărcată în hidrogeluri (Lot 1- Lot 3) au indicat că hidrogelurile au încărcat o cantitate de DOX cuprinsă între 1130 –1155 ng, cu ESR de 3.7 – 4.7%. În mediu cu pH 6.4, hidrogelurile eliberează o cantitate de DOX de aproximativ 120 ng/cm2. În intervalul de timp cuprins între 0.5-6h se eliberează o cantitate de DOX cuprinsă între 60-120 ng/cm2. În mediu cu pH 7.4, în același interval de timp, se eliberează o cantitate de DOX cuprinsă între 65-150 ng/cm2, cantitate de medicament care este superioară celei eliberate în mediu cu pH 6.4. Hidrogelurile proiectate demonstrează capacitate de încărcare cu DOX și eliberare controlată de medicament pe o perioadă de timp cuprinsă între 0.5-58h. Încă de la momentul inițial, hidrogelurile demonstrează capacitate de eliberare a DOX, rezultate care sunt susținute și de studiile biologice. Hidrogelurile încărcate cu DOX prin difuzie prezintă activitate anti-tumorală semnificativă prin reducerea numărului de celule viabile A375, specifice melanomului.
Act. 2.2 a vizat verificarea reproductibilității metodei de obținere. În acest scop au fost produse 3 loturi de hidrogeluri (100 de probe/lot) la intervale de 1 săptămână, conform rețetei de obținere optimizată în etapa I a proiectului. Toate cele 3 loturi, au prezentat o valoare constantă a fracției de gel (ESR 1,5%) și a densității (ESR 0.4 %). Hidrogelurile au prezentat un grad mai mare de absorbție în mediu similar celui tumoral în comparație cu mediu bazic caracteristic rănilor infectate. Din punct de vedere statistic, între loturile de hidrogel, ESR < 8%. Apreciem că funcție de acest parametru de calitate, între loturile de hidrogel din punct de vedere statistic, nu există diferențe care ar putea influența în mod critic calitatea hidrogelului. Sistemele de tip hidrogel au prezentat un comportament viscoelastic predominant (G’>>G”), iar din analiza FTIR, între loturile de hidrogel nu s-a observat o variație a benzilor de absorbție caracteristice, ceea ce arată că s-a asigurat obținerea unui hidrogel stabil și totodată, procesul de obținere este unul reproductibil.
Act. 2.3 a vizat evaluarea stabilității DOX în timpul procesului de iradiere care a fost testată prin cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă (LC-MS) în comparație cu o soluție standard de DOX neiradiată. În urma iradierii s-a observat formarea a opt produși de degradare. Dintre aceștia, trei sunt reprezentați de izomerii D559abc observați ca (–)m/z 558.16 și (+)m/z 560.17 care conțin câte un atom de oxigen în plus. Alt set de izomeri identificați sunt D398ab ((–)m/z 397.09 și (+)m/z 399.1), care corespund pierderii ciclului tetrahidropiran. Ruperea alternativă a legăturii eterice din structura DOX duce la formarea a D398ab, D412ab ((–)m/z 411.07 și (+)m/z 413.08). Diferența dintre cele două seturi de izomeri ce pierd ciclul tetrahidropiran este dată de prezența (D412ab) sau absența (D398ab) unei grupări carbonil la poziția legăturii eterice în structura DOX. Ultimul produs de degradare identificat a fost D529 ((–)m/z 528.15 și (+)m/z 530.17). Aceasta sugerează pierderea unui atom de carbon, cel mai probabil de la nivelul grupării metoxi, cu transformarea acesteia într-o grupare hidroxil. Pe baza acestor rezultate, s-a ales ca DOX să fie încărcată în hidrogel prin difuzie, ulterior procesului de reticulare prin iradiere.
Act. 2.4 a avut drept scop evaluarea potențialului citotoxic și anti-proliferativ al hidrogelului încărcat cu medicament (DOX) capabil să elibereze în timp o cantitate echivalentă cu doza IC50 (10 ng/ml) stabilită anterior. Aceste rezultate sugerează utilizarea hidrogelului dezvoltat în tratamentul alternativ al melanomului, drept platformă de eliberare țintită și controlată a medicamentului activ (DOX) la nivelul plăgii tegumentare.
ETAPA 3 - 2024
Etapa 3 de realizare a proiectului a avut ca obiectiv principal evaluarea rezultatelor științifice și identificarea elementelor de noutate care pot face obiectul unei cereri de brevet de invenție naționale.
S-a elaborat și înregistrat la Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci (OSIM) documentația tehnică pentru cererea de brevet de invenție cu titlul „PROCEDEU DE OBȚINERE HIDROGEL SEMISOLID BIOCOMPATIBIL CU ELIBERARE DE DOXORUBICINĂ ȘI ROL PRO-REGENERATIV” realizată de inventatorii: Demeter Maria (director de proiect), Călina Ion Cosmin, Scărișoreanu Anca Mariana, Cîmpean Anișoara (mentorul proiectului) - Cerere brevet de invenție A 00138/28.03.2024.